發酵黃芪對BALB/C小鼠免疫功能及細胞因子的作用
【摘要】 目的研究發酵黃芪對小鼠免疫功能及細胞因子的影響。方法將小鼠隨機分成正常對照組、免疫抑制組、黃芪對照組和發酵黃芪低、中、高3個劑量組(劑量分別為 1，2， 5 g/kg)，飲水法喂飼小鼠，分別檢測以下指標: 小鼠胸腺和脾臟指數，淋巴細胞亞群，淋巴細胞增殖功能，腹腔巨噬細胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。結果與免疫抑制對照組比較，發酵黃芪高、中劑量能顯著促進淋巴細胞的轉化，使CD3、CD4 、CD4/CD8明顯上調，促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力，促進白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL-2)的產生(P均<0.05)。結論發酵黃芪能提高機體的免疫功能，其作用機制與激活T細胞、T淋巴細胞亞群、巨噬細胞功能及促進細胞因子分泌有關。
【關鍵詞】 發酵黃芪; 免疫功能; 細胞因子; 小鼠
黃芪作為常用的補益類中藥，具有補氣固表及健脾利肺的功效。目前國內外現代研究也已證實，黃芪含有多糖、苷類、生物堿、黃酮、微量元素及其氨基酸等成分具有調節機體免疫功能的作用[1，2]。為了進一步開發傳統的中藥劑型，研究發酵黃芪對小鼠免疫系統及功能的作用，對傳統中藥的二次開發提供理論及應用的可行性依據。
1 材料與儀器
1.1 動物及細胞株健康BALB/C小鼠，雌雄各半7～8周齡，體質量18 ～22 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供;C57BL/6，雌性體質量18～20 g，一級動物，合格證號：冀醫動字第04035號。
1.2 藥品與試劑發酵黃芪由保定生物公司提供。RPMI-1640培養基、小牛血清：美國GIBCO公司;胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、刀豆蛋白(ConA)為Sigma公司產品。 抗Thy1、2;抗LST4、抗 Lyt2美國FLUKA公司;環磷酰胺，上海第二制藥廠制造，(CycloPhosPhamide， CP)。二甲基亞砜(DMSO)購于上海化學試劑公司，其余試劑均為分析純。
1.3 儀器倒置顯微鏡(PM-10AD)，OLYMOUS日本。二氧化碳孵箱(TC2323，美國SHEL.LAB公司);酶標儀(奧地利公司)。流式細胞儀，美國(FACS-420)。
2 方法
2.1 動物分組處理與給藥BALB/C小鼠隨機分成6組，每組7只動物，分別為生理鹽水對照組、環磷酰胺組、黃芪對照組、發酵黃芪小劑量組(1 g/kg)、中劑量組(2 g/kg)和高劑量組(5 g/kg)。黃芪組(1 g/kg)每天每只灌服0.5 ml，對照組灌服等量生理鹽水。環磷酰胺組ip給藥連續3 d造模。第8天各組頸椎脫臼處死小鼠，無菌取胸腺、脾測定。
2.2 臟器/體重比值測定實驗結束，稱質量、胸腺重、脾重，取小鼠脾臟和胸腺稱重(濕重)，計算臟器指數(%)=臟器重量(g)/動物質量(g)×100%。
2.3 小鼠脾細胞懸液的制備及脾淋巴細胞活力的檢測采用MTT法[3] 小鼠分組與喂飼方法同上。 無菌取脾，經過研磨200目細胞篩網過濾、經常規裂解紅細胞，hank's液洗滌，離心2次，制得單細胞懸液，最后用含10%小牛血清RPMI-1640調細胞濃度5×106個/ml，接種于96孔板(100 μl/孔)，每組6個平行孔，每孔100 μl。37℃保濕培養68 h后，每孔加MTT 10 μl，繼續培養4 h后，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩5 min，紫色結晶完全溶解后于酶標儀570 nm測定A值。
2.4 小鼠脾細胞亞群測定(流式細胞儀)[4]將6～8周齡、體質量(20±2) g BALB/C雌性小鼠隨機分成6組，每組6只。無菌取小鼠胸腺細胞，4%甲醛固定，預冷PBS清洗，加入熒光標記的CD3、CD4、CD8單克隆抗體50 μl，37 ℃ 30 min， 1 000 r/min離心10 min，加入熒光標記的二抗工作液50 μl，37 ℃ 30 min，RNase消化，1ml碘化丙，每份樣本平均測定1×104個，分析相應陽性細胞的含量。
2.5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能測定[5] 小鼠分組與喂飼方法同上。按常規制備小鼠腹腔巨噬細胞，置24孔培養板每孔加細胞懸液1 ml，5% CO2，37 ℃ 培養2 h，去上清液，用RPMI 1640培養液洗去未貼壁細胞，每孔加入0.1%中性紅生理鹽水液1ml，5% CO2，37℃培養2 h后，甩棄中性紅，并用預溫的BPS清洗未吸收的中性紅，吸水紙吸干，每孔加入細胞裂解液1 ml，靜置4 ℃ 過夜，用蒸餾水調零，于722分光光度計550 nm處測定吸光度A值，A值表示巨噬細胞吞噬功能的強弱。
2.6 腹腔巨噬細胞產生IL-1的誘生及測定[5]小鼠分組與喂飼方法同上。將24孔板中貼壁純化的腹腔巨噬細胞各孔加入LPS(終濃度10 μg/ml)培養24 h后收獲上清，為誘生的IL-1粗品，-20 ℃ 保存待測。無菌取C57BL/6小鼠胸腺細胞，用10%小牛血清的RPMI-1640清洗并調細胞濃度1×107個/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，同時加入1∶4稀釋的誘生IL-1 0.1 ml，ConA(終濃度2.5 μg/ml)0.1 ml，每只鼠3個復孔，置5%CO2，37 ℃ 培養，用MTT比色法測定胸腺細胞的增殖。
2.7 脾細胞IL-2的誘生及測定[6]小鼠分組與喂飼方法同上。按常規制備脾細胞，調細胞濃度為2.5×106個/ml，置24孔板孔/1ml，加入ConA(終濃度2.5 μg/ml)1 ml/孔，置5% CO2，37 ℃ 培養40 h后，收獲上清為誘生的IL-2，-20℃保存待測。常規制備正常小鼠脾細胞，調細胞濃度2.5×106個/ml，加入96孔平底板，每孔0.1 ml，加入1∶8稀釋的誘生IL-2 0.1 ml，每只鼠3個復孔，同時加入ConA(終濃度2.5 μg/ml)0.1ml，5 %CO2，37 ℃ 培養，用MTT比色法測定T淋巴細胞的增殖。
2.8 統計學處理實驗數據用±s表示，統計分析采用SPSS11.5軟件進行F檢驗和q檢驗。
3 結果
3.1 發酵黃芪對小鼠脾、胸腺指數的作用由表1可見，黃芪及發酵黃芪與環磷酰胺組相比較對胸腺重量影響不明顯，無顯著性差異(P>0.05)，但是與環磷酰胺對照組比較可以顯著提高脾臟指數，差異有顯著性，且有劑量依賴關系，發酵黃芪可顯著增加小鼠脾臟指數。表1 發酵黃芪對小鼠脾、胸腺指數的影響(±s)%
3.2 發酵黃芪對淋巴細胞增殖的影響由表 2 可見，發酵黃芪ig給藥在高劑量能明顯促進小鼠T 淋巴細胞的增值，發酵黃芪高劑量組與環磷酰胺對照組相比均能明顯促進脾淋巴細胞分泌IL-2 ，且有劑量反應關系，能拮抗環磷酰胺對淋巴細胞的抑制作用。表2 發酵黃芪對小鼠T 淋巴細胞增殖及T細胞產生IL-2的影響(±s)
3.3 發酵黃芪對小鼠脾淋巴細胞亞群的影響表3表明，發酵黃芪ig給藥在中、高劑量使CD3，CD4 ，CD4/CD8明顯上調，拮抗環磷酰胺對淋巴細胞亞群的抑制作用。表3 發酵黃芪對小鼠脾淋巴細胞亞群的影響(±s)
3.4 發酵黃芪對腹腔巨噬細胞吞噬功能及分泌細胞因子IL-1的影響表4表明，發酵黃芪ig給藥在中、高劑量能明顯促進小鼠腹腔巨噬細胞的增值及IL-1的分泌，能拮抗環磷酰胺對淋巴細胞的抑制作用。
4 討論
中藥對機體具有一定的免疫調節作用，黃芪及其有效提純物的免疫增強作用已被認識，機體免疫功能的提高對機體的抗病能力、保證人體健康有重要作用。表4 發酵黃芪對環磷酰胺抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能及分泌IL-1的影響(±s)
胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，主要含有T 細胞、B 免疫細胞，在促有絲分裂劑的作用下會發生增殖反應和細胞因子的分泌。本試驗結果表明發酵黃芪能通過增加小鼠脾臟指數，促進脾T淋巴細胞的增殖、活化，以及淋巴細胞亞群CD4+T細胞的上調、CD4+/CD8+比值上升，促進細胞因子IL-2的分泌提高機體的特異性 免疫功能。本實驗發酵黃芪中、高劑量均能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能及IL-1的分泌; 提高機體的非特異性免疫功能。IL-1主要來源于腹腔巨噬細胞，具有多種生物學作用，可以提高T細胞的增殖能力、促進IL-2的合成和分泌而達到促進免疫功能的作用。
總之，本次實驗結果提示傳統中藥的發酵處理，對小鼠的免疫功能不僅同樣有增強作用，且療效要強。采用生物發酵工藝加工炮制是傳統中藥的重要方法。目前我國來源于生藥的活性成分的生物轉化研究仍處于起步階段。這為中藥的二次開發提供一定的線索，值得進一步的研究。
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