探析神經系統相關蛋白的研究進展
摘要：特異性蛋白在神經系統的再發育或再生中能夠決定和誘導神經突起沿正確方向生長。有兩類蛋白較為重要，一類能夠在神經損傷后誘導促進神經突起生長;另外一類能夠指引神經突起的延伸方向。很多特異性蛋白已經進入到研究者視野，其中包括GAP?43、p38、L1黏附分子、外周髓鞘蛋白?22等。本文將著重探討GAP?43與p38的變化與意義。
關鍵詞： 神經系統相關蛋白;GAP?43;p38
1 生長相關蛋白GAP?43
20世紀80年代初，Skene等人發現了一種富含于生長錐中的神經組織特異性磷酸蛋白質，將其命名為生長相關蛋白(growth?associated protein 43，GAP?43)。GAP?43在神經纖維的生長、發育、軸突再生以及突觸功能的維持等方面起著重要作用，并參與神經遞質釋放的調節，被認為是神經元發育和再生的一個內在決定因子〔1〕。
1.1 GAP?43的結構及生化特性 GAP?43又名B50、F1、pp46、神經調節素，含有226～243個氨基酸，只1個芳香族氨基酸殘基，但丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)的含量極豐富。其等電點4.3～4.5。不同種屬間GAP?43的分子量有微小差別，大鼠GAP?43的分子量為23.6 kD，人類GAP?43的分子量為24.8 kD〔2〕，編碼GAP?43蛋白的基因位于人的第3染色體，在大鼠中位于第16染色體，人和大鼠的GAP?43基因均為單拷貝，包括2個啟動子和3個外顯子，第1個外顯子編碼第1～10位氨基酸，包括蛋白的膜結合域和G0、Gia1活性域。第2個外顯子編碼的氨基酸包括蛋白激酶C(PKC)的特異性磷酸化位點Ser41和其他的磷酸化位點以及與鈣調素(CaM)結合的“IQ區域”;GAP?43通過N末端的Cys3Cys4的棕櫚酰化與膜連接。第3個外顯子編碼蛋白的羧基末端，其中包括一個F?motif,猜測其可能與細胞骨架成分相互作用〔3，4〕。根據克隆到的大鼠、小鼠、牛以及人等的cDNA序列，不同物種GAP?43一級結構具有高度的同源性，活性位點基本一致，氨基末端的短水解區是與膜的結合位點，第41位絲氨酸是PKC催化的磷酸化作用活性位點，第43～51位氨基酸構成與CaM的結合位點。
GAP?43是神經特異性的CaM連接蛋白，是PKC特異性的底物之一，其磷酸化主要由βⅡ?PKC調控,磷酸化發生在其第41位絲氨酸殘基上〔5〕。其二級結構以無規則卷曲為主，整個分子呈棒狀，具有很強的柔性。GAP?43具有高親水性并可能通過與膜脂肪酸共價連接而與神經元膜結合，在突觸前膜和生長錐的動態結構中含量極高，胞漿中含量極低，所以GAP?43可能從生長錐或突觸膜表面伸展開來，一方面與胞質及細胞結構蛋白相互作用，另一方面可逆的附著在膜表面〔2〕。
1.2 GAP?43的分布及表達 GAP?43在脊椎動物非神經組織很少表達，所以被認為是神經系統特異性蛋白。它廣泛存在于大腦、小腦、脊髓以及自主神經系統的神經元內，在生長、分化和再生的軸突末端以及突觸前膜含量極高。在發育中的神經元沿整個軸突表達，在生長錐表達尤其豐富，在哺乳動物中樞神經系統早期發育過程中有大量的軸突生長及突觸形成，此時存在著高水平GAP?43的合成及隨軸漿的運輸，隨著神經元的發育成熟和突觸聯系的建立,其合成及運輸明顯下降。正常成年大鼠腦內許多區域有GAP?43免疫組化反應陽性物，在成熟神經系統分布于某些特定區域的神經終末中，在神經膠質細胞中也有表達〔6，7〕。在中樞神經系統，陽性物彌散分布于皮質中〔8〕，在邊緣系統和聯合區，包括與突觸可塑性相關的一些區域如海馬和嗅球，GAP?43呈持續高水平表達〔9〕。成人腦中GAP?43 mRNA在聯絡區水平較高，其他區域和皮質下區都很低〔5〕。
1.3 GAP?43的生理作用及作用機制
1.3.1 生理作用 GAP?43及其mRNA在神經系統的表達分布特點表明它對神經發育和可塑性可能有重要作用，在發育和再生中軸突延長和突觸形成整個時期表達都增加〔10〕。其作為神經元特異性的突觸前膜蛋白，通過磷酸化?去磷酸化、棕櫚酰化?去棕櫚酰化調節、引導軸突生長和調節新連接形成而影響軸突生長能力，即使在缺乏其他營養因子時也能使神經元發出新的終末,并調節突觸延伸和可塑性，以及神經遞質的釋放，所以GAP?43被認為是神經元生長期的內在決定因子，可作為神經再生的標志〔6〕。轉基因鼠的實驗顯示編碼GAP?43的外來基因的高水平過量表達可引起異常連接的自發形成〔11〕,表明高水平的GAP?43可能與神經元的再生修復具有密切的關系。
1.3.2 作用機制 關于GAP?43的作用機制不十分明確，目前的研究主要集中在以下四點〔12〕：(1)GAP?43與膜骨架的關系及膜連接作用。GAP?43最初在高爾基器內與神經元膜成分結合，最后多聚集于軸突突觸前終末，然后通過其N末端的疏水性片段緊密連接在神經終末質膜胞質面，質膜內表面的蛋白網狀結構可決定軸突終末的形狀、活動性和通路引導。在生長錐，GAP?43通過與組成網狀結構的膜骨架蛋白如肌動蛋白、胞影蛋白等結合而影響突觸前終末的生長狀態〔13〕。 (2)GAP?43與CaM的關系。GAP?43是鈣激活蛋白家庭的一員，含有一個“IQ”基序，可調節Ca2 流量及效力〔14〕。GAP?43作為一個位于生長錐和突觸前末端中的CaM結合蛋白，在正常情況下，GAP?43與CaM結合，將CaM隔離于神經元膜區域，這種結合受到GAP?43磷酸化過程中的產物磷脂酰肌醇?4,5?二磷酸(PIP2)的負調控。同時，GAP?43與CaM的親和性也是Ca2 濃度依賴的:當Ca2 低水平時，GAP?43與CaM緊密結合，當Ca2 進入細胞后水平增高時便解離釋放CaM，同時GAP?43磷酸化，活化的GAP?43進一步與細胞骨架成分相互作用，調節神經末端活力，進而改變細胞形態〔6，10〕。(3)磷酸化和去磷酸化。基因鼠過表達假磷酸化蛋白(將GAP?43的磷酸化位點Ser41用另一帶電氨基酸取代來模仿磷酸化)能誘導偽足生長、細胞黏附和肌動蛋白重組，使海馬中產生大量投射纖維;反之，過表達去磷酸化GAP?43 的轉基因鼠的細胞出芽就大為減少。這表明，GAP?43在Ser41的磷酸化可促進細胞的生長和出芽〔12〕。(4)在信號傳遞中的作用。GAP?43在磷脂代謝和Ca2 信號傳遞中也起了重要作用。在第二信使系統中，PIP2在磷脂酶C (PLC)催化下可水解產生甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3) ，DAG的主要作用是激活PKC，而IP3能誘發Ca2 由胞內Ca2 儲池釋放，提高胞漿中游離Ca2 的濃度。磷酸化GAP?43能抑制純化PIP?PIP2激酶的活性，從而抑制PIP2產生，成為PKC和Ca2 代謝的反饋抑制劑。另外PKC可由非PIP2途徑激活并使GAP?43磷酸化而抑制IP3依賴的Ca2 代謝，使胞內Ca2 處于低濃度水平，這
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