殼聚糖的復(fù)合法降解及降解產(chǎn)物降血糖活性的研究
【摘要】 目的研究復(fù)合法降解殼聚糖及降解產(chǎn)物的生物活性方法在纖維素酶降解的后期引入H2O2氧化降解殼聚糖。觀察其降解產(chǎn)物對(duì)糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響。結(jié)果最佳工藝條件為：纖維素酶降解時(shí)酶糖比0.2，pH 4.6、50℃、時(shí)間為3 h，后續(xù)H2O2降解時(shí)H2O2用量為0.8～1.0(ml/g)、75℃、時(shí)間為1.5 h，所得降解產(chǎn)物的平均分子量約為1 700。工藝所生產(chǎn)的低聚殼聚糖用量為 100 mg/kg時(shí)具有明顯的降血糖生物活性，其功效甚至優(yōu)于拜糖蘋(píng)。結(jié)論該復(fù)合降解工藝具有成本低，易于工業(yè)化，而且所得產(chǎn)品具有較高的生物活性。
【關(guān)鍵詞】 殼聚糖; 低聚殼聚糖; 降解; 血糖; 生物活性
殼聚糖作為天然堿性多糖，其資源量?jī)H次于纖維素，分子量從幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等。降解后的低聚殼聚糖因溶解性增強(qiáng)，容易被吸收利用，尤其是分子量在1 500左右的產(chǎn)品顯示出獨(dú)特的生理活性和功能[1]。目前，由殼聚糖降解制備優(yōu)質(zhì)低聚殼聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)成為該多糖廣泛推廣使用的瓶頸。在已有研究的眾多降解方法中，非專(zhuān)一性酶降解和H2O2氧化降解法比較有望實(shí)現(xiàn)大規(guī)模化生產(chǎn)。其中H2O2氧化降解具有成本低、降解速度快、產(chǎn)品無(wú)殘毒等優(yōu)勢(shì)。但反應(yīng)在H2O2用量大、溫度高及反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的條件下易發(fā)生副反應(yīng)，制備產(chǎn)品的活性也受到質(zhì)疑。與其相比，酶降解由于無(wú)副反應(yīng)、降解條件溫和、降解過(guò)程容易控制、產(chǎn)品生物活性高而引起人們的廣泛關(guān)注[2]。在眾多非專(zhuān)一性酶的篩選過(guò)程中，纖維素酶因存在廣泛，生產(chǎn)成本低，對(duì)殼聚糖具有一定降解作用而受到重視，但纖維素酶活力有限，降解效率低，產(chǎn)物分子量分布較寬[3]。為此，本研究在纖維素酶降解的后期向體系內(nèi)引入H2O2快速氧化降解，以提高反應(yīng)速率、縮小產(chǎn)品分子量分布寬度。最后對(duì)制備的低聚殼聚糖產(chǎn)品進(jìn)行降血糖生物活性研究，以評(píng)價(jià)該制備工藝的可行性。
一、 器材
1.1 材料殼聚糖，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司，脫乙酰度>90%;纖維素酶，天津麗華制劑廠，酶活力≥40 000 U·mg-1;H2O2，30%分析純。拜糖蘋(píng)，北京拜爾醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品;四氧嘧啶，Sigma公司提供。
1.2 儀器20m3柔性反應(yīng)釜，德國(guó)進(jìn)口;小型板框壓濾機(jī)，浙江省海寧市豐源過(guò)濾設(shè)備有限公司;DZF-6050型離心噴霧干燥器，常州市一步干燥設(shè)備廠;LC-10AD凝膠色譜儀，日本島津;血糖儀，上海榮盛生物技術(shù)有限公司提供。
1.3 動(dòng)物3月齡雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20 ～30 g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
二、方法
2.1 降解實(shí)驗(yàn)
2.1.1 纖維素酶的降解實(shí)驗(yàn)在攪拌的情況下，將200 g殼聚糖按1∶50(W/V)混合，加入適量冰醋酸溶解后，快速升溫至所需溫度，加纖維素酶進(jìn)行恒溫降解。達(dá)到預(yù)定時(shí)間后迅速升溫至100℃使酶失活，取樣稀釋過(guò)濾、用凝膠色譜分析產(chǎn)物的平均分子量[3]。實(shí)驗(yàn)以酶糖比n、pH和溫度T為主要影響因素設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，得最佳組合工藝條件為n=0.1，pH=4.6，T=50℃。
2.1.2 H2O2氧化降解工藝條件的確定在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上升溫至預(yù)定溫度，加入H2O2后繼續(xù)降解，到預(yù)定時(shí)間后取樣、過(guò)濾分析產(chǎn)物平均分子量。最后在確定的最佳復(fù)合降解工藝條件下對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，卸料降溫，板框壓濾、噴霧干燥后待用。
2.2 降解物對(duì)糖尿病小鼠生化指標(biāo)的影響
2.2.1 高血糖模型的復(fù)制及分組小鼠禁食12 h，四氧嘧啶生理鹽水溶液(2%)腹腔注射(一次性給藥)，劑量為180 mg/kg，72 h后空腹尾尖取血，血糖儀測(cè)血糖，大于11 mol/L的小鼠入選糖尿病模型。取10只正常小鼠為正常組。將造模成功的小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為模型組，殼聚糖原料組(100 mg/kg)，低劑量降解產(chǎn)物組(100 mg/kg)，高劑量降解產(chǎn)物組(200 mg/kg)，拜糖蘋(píng)治療組(20 mg/kg)。灌胃1次/d，連續(xù)給藥28 d。正常組和模型組灌胃生理鹽水。
2.2.2 動(dòng)物標(biāo)本留取每天觀察各組小鼠的進(jìn)食量、飲水及尿量;給藥14 d和28 d后尾尖取血，血糖儀測(cè)血糖;實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠被斷椎處死，取肝、腎組織，用濾紙吸干表面血跡后稱(chēng)重。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)用 ±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。
三、結(jié)果
3.1 纖維素酶的降解過(guò)程研究為了考察纖維素酶的催化降解過(guò)程，在正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳組合條件下對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解，產(chǎn)物的平均分子量Mw隨時(shí)間的變化情況見(jiàn)圖1。
纖維素酶降解過(guò)程
圖1表明，在開(kāi)始降解的0.75 h內(nèi)，產(chǎn)品平均分子量迅速下降。這也證實(shí)了纖維素酶對(duì)殼聚糖主要進(jìn)行內(nèi)切降解反應(yīng)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，殼聚糖聚合度減小，產(chǎn)物平均分子量下降趨勢(shì)變緩。這與產(chǎn)物濃度的增加在一定程度上抑制了降解反應(yīng)的進(jìn)行有關(guān)。當(dāng)降解達(dá)到3 h后，產(chǎn)物的平均分子量下降趨勢(shì)非常微弱，維持在2萬(wàn)左右。因此，可在纖維素酶降解3 h后，引入H2O2進(jìn)行降解。
3.2 H2O2氧化降解工藝條件的確定
3.2.1 溫度對(duì)降解過(guò)程的影響在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上，不同溫度條件下H2O2氧化降解殼聚糖過(guò)程見(jiàn)圖2。
溫度對(duì)H2O2降解過(guò)程的影響 圖2表明，引入H2O2后產(chǎn)物平均分子量迅速下降，降解速率基本上與溫度呈正比。這可能是殼聚糖分子內(nèi)部尚存在少量易斷裂 “弱鍵”，如：少數(shù)鏈節(jié)上具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)、存在少數(shù)戊糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、或存在少數(shù)開(kāi)環(huán)的半縮醛鏈節(jié)結(jié)構(gòu)。之后產(chǎn)物平均分子量下降比較平緩，且溫度越高進(jìn)入平緩階段越早。此外，在反應(yīng)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，在高于80℃條件下降解時(shí)，所得產(chǎn)物顏色隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚覝囟仍礁咦兓矫黠@。分析認(rèn)為當(dāng)殼聚糖降解到一定程度后，其空間結(jié)構(gòu)由卷曲狀轉(zhuǎn)變成短的直鏈狀，氨基基團(tuán)活躍性增強(qiáng)，易發(fā)生羰氨副反應(yīng)。為了有效控制副反應(yīng)消耗具有生物活性的氨基，確定后期H2O2氧化反應(yīng)溫度為75℃、時(shí)間為1.5 h。
3.2.2 H2O2用量對(duì)降解過(guò)程的影響在纖維素酶降解的基礎(chǔ)上，質(zhì)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%H2O2的用量與殼聚糖用量的比值n對(duì)降解過(guò)程的影響見(jiàn)圖3。
H2O2用量對(duì)降解過(guò)程的影響
由圖3可以看出，在反應(yīng)時(shí)間和溫度相同的條件下，降解產(chǎn)物的平均分子量隨H2O2用量的增加而下降。當(dāng)用量比增加到0.8以后，下降趨勢(shì)明顯變緩。由此確定后續(xù)H2O2的最適用量比值為0.8～1.0(ml/g)。此時(shí)，可獲得平均分子量約為1 700左右的降解產(chǎn)物。
采用纖維素酶與雙氧水復(fù)合降解殼聚糖與直接采用雙氧水降解相比，雙氧水降解時(shí)間縮短將近50%，產(chǎn)品平均分子量低且顏色較淺[4]。分析認(rèn)為，殼聚糖溶液經(jīng)過(guò)纖維素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，從而抑制了雙氧水可能對(duì)部分殼聚糖過(guò)度降解。此外，降解時(shí)間縮短也很好地限制了副反應(yīng)的發(fā)生。
3.3 降解產(chǎn)物的降血糖活性研究
3.3.1 一般情況的觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化見(jiàn)表1。表1 小鼠體重、血糖及內(nèi)臟重量的變化與正常組對(duì)照，1P<0.01，2P<0.05;與模型組對(duì)照，3P<0.01，4P<0.05
經(jīng)四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出現(xiàn)飲食量增加、多飲多尿、體毛松散及精神萎靡等癥狀。未經(jīng)治療的模型組“三多”癥狀尤其突出，體重也明顯低于正常組(P<0.05)。低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋(píng)治療組的一般癥狀得到明顯改善，體重與正常組無(wú)顯著差異。殼聚糖原料和高劑量降解產(chǎn)物治療組的癥狀改善居中。
3.3.2 降解產(chǎn)物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響與模型組相比，殼聚糖原料治療組血糖值雖然有所降低，但并不存在顯著性差異。原因?yàn)闅ぞ厶潜旧矸肿恿窟^(guò)大，不能被有效吸收所致。而高、低劑量降解產(chǎn)物和拜糖蘋(píng)治療組的14，28 d血糖值明顯低于模型組(P<0.01)。其中，低劑量降解產(chǎn)物的降血糖效果甚至優(yōu)于拜糖蘋(píng)。由此說(shuō)明殼聚糖原料經(jīng)過(guò)本工藝降解后具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。與正常組相比，單獨(dú)使用降解產(chǎn)物并不能使血糖降到正常值。
3.3.3 降解產(chǎn)物對(duì)糖尿病小鼠內(nèi)臟的影響由表1中的數(shù)據(jù)分析可知，除拜糖蘋(píng)治療組外(P<0.05)，其它治療組的肝臟指數(shù)雖然高于模型組，但不存在顯著性差異。這說(shuō)明殼聚糖及降解產(chǎn)物對(duì)肝臟具有一定保護(hù)功能，但效果不顯著。同時(shí)也證實(shí)了臨床上廣泛使用的拜糖蘋(píng)降糖藥具有對(duì)肝臟損害小的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于腎臟，低劑量降解產(chǎn)物治療組的指數(shù)與正常組較接近，而其它治療組的肝臟指數(shù)與模型組接近，明顯高于正常組(P<0.01)。可見(jiàn)，使用一定劑量本工藝生產(chǎn)的低聚殼聚糖對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行治療時(shí)，可同時(shí)達(dá)到保護(hù)肝、腎的功效。有關(guān)低聚殼聚糖降糖作用機(jī)制目前尚不清楚。大多推測(cè)為，殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的大量氨基調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)pH呈弱酸性，從而增強(qiáng)胰島素的活性。也有人認(rèn)為降解后的低聚殼聚糖對(duì)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)α-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻礙了它從碳水化合物和有關(guān)多糖的非還原端切下葡萄糖[5]。根據(jù)本研究結(jié)果，降解產(chǎn)物的治療效果與拜糖蘋(píng)比較接近，而拜糖蘋(píng)正是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，因此，偏向于后者。
四、 結(jié)論
本研究提出了一種纖維素酶結(jié)合雙氧水降解殼聚糖的復(fù)合降解方法。實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝條件為：纖維素酶降解時(shí)酶糖比為0.2、pH4.6、反應(yīng)溫度為 50℃、時(shí)間為3 h，后續(xù)H2O2降解時(shí)30% H2O2用量與殼聚糖原料的比值為0.8∶1.0(ml/g)、75℃、時(shí)間為1.5 h，所得降解產(chǎn)物的分子量約為1 700。降解產(chǎn)物對(duì)糖尿病小鼠降血糖研究表明，用量100 mg/kg時(shí)具有明顯的降血糖生物活性，且起效較快。其功效甚至優(yōu)于拜糖蘋(píng)。此外，對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行治療時(shí)，可同時(shí)起到保護(hù)肝、腎的功效。
因此，該降解工藝不僅有效結(jié)合了非專(zhuān)一性酶和雙氧水氧化降解的優(yōu)勢(shì)，具有成本低，易于工業(yè)化，所得產(chǎn)品具有較高的生物活性。
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